奥默毕赤酵母菌致败血症一例

Part 1.纳米制剂表征

1.1纳米颗粒的形态学表征PMID：32554031、31465938

采用扫描/透射电子显微镜（SEM/TEM）观察纳米凝胶的形貌。

1.2纳米颗粒的化学表征PMID：32554031、31465938

1.3包封率和负载力（①客户PPT提供方案，②PMID：32545473，两选一）

①测定A-DiR 在纳米颗粒中的包封率：收集上清液，10,000 g离心40 分钟后，适当稀释，用发光光谱仪测定DiR的含量。如下所示计算药物包封效率和负载能力：

②紫外可见分光光度计用于评估聚合物纳米颗粒中包裹的药物量。

1.4体外释放PMID：33657949、32545473

将透析袋中体积为10 mL的制剂加入50 mL PBS溶液中，该溶液在振荡水浴中保持在37 ℃，用于估计药物释放。在0.25至48小时（释放时长需根据制剂进行调整）确定时间间隔后取出2 mL PBS 溶液，并通过紫外-可见分光光度计在408 nm波长下进行分析。

1.5血凝试验

采用血细胞凝集试验证实OL在纳米颗粒表面的生物活性。OL-ANP和ANP与大鼠的1% (v/v) 新鲜红细胞悬液在37°C下孵育30 分钟。在显微镜下观察悬浮液。

1.6稳定性PMI：28865359

Part 2.体外研究

2.1细胞毒性PMID：33307160、28865359

两种人细胞系用于生存能力研究：人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)和人鼻中隔细胞系(RPMI-2650)。

SH-SY5Y细胞系在含有0.04M碳酸氢钠DMEM培养基中培养。RPMI-2650细胞系在EMEM培养基中培养，添加Earle盐和碳酸氢钠，添加2mm谷氨酰胺和1%非必需氨基酸。两种细胞培养基中均添加了10% FBS和1%的青霉素-链霉素混合物。细胞使用0.25%胰蛋白酶-edta溶液每周传代2-3次，在37 ℃、5% CO2和95%相对湿度下培养。

孵育过夜（40-50%的一致性），1.37至3,000 μg/ml的ANP和OL-ANP悬浮液以及浓度为0.152至333μg/ml的OL溶液在含有20% FBS 的DMEM 中在37°C 下培养4 小时。以5% DMSO为阳性对照，阴性对照为无处理对照。孵育24和48h后，CCK-8测定各组细胞活力。

（分组：阴性对照组、不同浓度ANP和OL-ANP组（至少5个浓度）、阳性对照组）

2.2黏膜粘附体外评估PMID：29240797、31920290、31266990、32168767（几种不同方法）

使用改良的平衡技术，使用两个玻璃瓶和羊鼻粘膜。从羊鼻腔的嗅觉区域切下厚度为0.6 mm、表面积为2.835 cm2的鼻粘膜，并立即用线将粘膜侧朝外固定到每个玻璃瓶上。小瓶在32–34℃下储存10分钟。将一个小瓶连接到天平的一侧，并将0.5 ml凝胶样品放置在连接到小瓶底部的两个粘膜之间。测量了破坏粘膜粘附所需的最小水重量。

粘粘附强度（dynes/cm2）=mg/A

注：其中m为脱离所需的重量，g为重力引起的加速度（980cm/s2），A为黏膜暴露的表面积（cm2）。

（分组：空白对照组、ANP组、OL-ANP组）

2.3渗透传输研究PMID：34925013、31465938、28865359、31920290

RPMI 2650细胞以2×105个细胞/孔的密度接种在12孔Transwell上室小孔（1.12 cm2，0.4μm孔径）中。试验在接种23天后进行，接种4天后从细胞层顶端（AP）取出培养基，在气液界面诱导上皮分化。每周更换三次来自基底外侧（BL）隔室（0.5 ml）的培养基。用Evom®STX2电压表监测极化细胞多层膜的跨上皮电阻（TEER），以评估膜的完整性。TEER值高于50 Ω cm2可用于渗透分析。从顶端到基底外侧（AP-BL）的运输研究进行。去除培养基并用含10 mM HEPES（pH 7.4）的Hanks平衡盐溶液（HBSS）替换。在37 ℃下摇动（45 rpm）稳定后，向AP侧（0.5 ml）添加治疗溶液（ANP、OL-ANP制剂）。孵育30、60、90、120和180分钟后，从BL侧（1.5 ml）取出等分试样（240μl）。使用HPLC检测试样中药物浓度。

注：式中，dQ/dt为渗透速率；A是膜的表面积（单位：cm2）；c0是AP室中的初始药物浓度。

注：式中，C f是供体或受体（CRf）室中的最终化合物浓度；c0是供体室中的初始浓度；Vd和Vr分别是供体和受体室的体积。

（分组：空白对照组、ANP组、OL-ANP组）

Part 3.体内研究

3.1黏膜毒性（客户PPT提供方案）

使用聚乙烯10（PE 10）管连接到各组（n = 3）的鼻孔中，依次给予ANP、OL-ANP（25 mg/ml）或生理盐水10μl持续一周。微升注射器。末次给药后24小时处死大鼠，取鼻黏膜。对鼻黏膜的石蜡切片（5 μm厚）进行免疫组织化学染色，用于神经元特异性烯醇化酶（NSE）检查。切片用兔抗神经特异性烯醇化酶多克隆抗体孵育，用SABC试剂盒进行，最后用DAB染色。使用显微镜获得切片图像。

（分组：空白对照组、ANP组、OL-ANP组）

3.2体内分布（活体成像）PMID: 32554031

采用荧光成像技术研究DIR标记的ANP及OL-ANP在大鼠体内的分布。采用罗丹明B制备DIR标记的ANP及OL-ANP纳米制剂。实验前，体重220-240g的雄性小鼠大鼠禁食12h，自由饮水。大鼠经鼻内给药ANP及OL-ANP纳米制剂（剂量）。采用CRI荧光成像系统(2、5、30、60、120、240、480、720min)观察大鼠ANP及OL-ANP纳米制剂在脑、肺、肝和肾中的分布。

（分组：空白对照、鼻内给予ANP/DiR组、鼻内给予OL-ANP/DiR组）

3.3药代动力学研究（HPLC）PMID：32610539、34925013

在Wistar大鼠采用鼻内给予ANP和OL-ANP及静脉滴注两性霉素B，以指定的时间间隔收集血液样本。每个时间间隔处死每组六只大鼠，取出后用生理盐水清洗整个脑，然后称重。用磷酸盐缓冲液（pH 7.4）在5000rpm下匀浆脑组织3分钟。使用HPLC检测试样中药物浓度。

（分组：空白对照、鼻内给予ANP组、鼻内给予OL-ANP组、静脉注射两性霉素B组）

3.4药效学研究PMID：33657949、34189154、28320715、客户PPT提供方案

通过检测脑脊液中隐球菌数、乳胶凝集试验（LAT）和病理组织切片来评价疗效。大鼠模型：菌株H99（血清型A）从-80 °C恢复。制备浓度为2×108CFU/mL的菌悬液，将50 uL菌悬液注入颅内，建立隐球菌脑膜炎大鼠模型。注射前取相同体积的脑脊液以维持颅内压。所有大鼠被分成四个随机组（每组10只大鼠）。第1组为假手术组，其余三组均建立隐球菌脑膜炎大鼠模型。接种后第7天，第3组和第4组分别鼻内给予ANP和OL-ANP（给药浓度待确认），第1组假手术组和第2组模型组不干预。在第14天和第21天，取100ul脑脊液（CSF）进行CSF培养并进行LAT以比较治疗效果，并在治疗后的最后一天处死各组大鼠，并取各组大鼠进行病理组织切片。

乳胶凝集试验（LAT）：使用涂有抗CrAg抗体的乳胶颗粒。CSF样品分别用热处理或用链霉蛋白酶溶液孵育。将样品与隐球菌乳胶混合，并读取结果。将显示颗粒或团块的样本与制造商的阳性对照进行比较，并评估样本的阳性率。PMID: 34189154

病理组织切片：收集大脑并放入10%中性缓冲福尔马林中进行组织病理学评估。对福尔马林固定的组织进行修剪，通过蔗糖替代物进行冷冻保护，然后嵌入OCT冷冻培养基中。制备约5 μm切片用于染色。用市售的针对新型隐球菌的小鼠单克隆抗体用于确定感染程度（MyBioSource，LLC，San Diego，CA）。PMID: 28320715

（分组：假手术组、模型组、ANP组、OL-ANP组）